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糖基化太復雜?賽默飛離子色譜讓你迎糖而上!

來源: 賽默飛世爾科技   2019-8-28   訪問量:1011評論(0)

糖基化分析的重要性

單抗藥物是近年來發展最快的藥物品種,在整個藥物市場產值中已經占有超過12%的份額,超過1200億美元。目前,全球已經批準的單克隆抗體藥物超過了80個,年銷售額增長率超過30%,主要應用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領域。國內各大醫藥企業也聚焦于單抗藥物的研發。

單克隆抗體結構主要由Fab和Fc兩大功能區組成,在Fab段和Fc段特定的位點存在糖基化修飾。這些糖基化修飾發揮著極其重要的作用:能夠維持抗體的空間構象、穩定抗體的結構,提高藥物的熱穩定性;糖鏈結構還能保護抗體不受某些蛋白酶水解,延長半衰期,提高藥效;Fc段的糖基化修飾還會對抗體的安全性造成影響。因此抗體的糖型檢測在產品質量控制中就非常重要

目前的分析方法

糖鏈常用的分析方法有:液相色譜法、毛細管電泳法和高效陰離子交換色譜法。但無論是液相色譜法還是毛細管電泳法,都必須使用專用試劑進行熒光衍生。此衍生耗時長(4小時)且會導致唾液酸丟失,不能準確分析含唾液酸樣品。且也無法分析磷酸化糖及硫酸化糖。而離子色譜無需衍生,定量準確,可以覆蓋分析所有糖類型

離子色譜-糖分析方法

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法,是目前領先的糖分析方法,具有無需衍生、分離度好、靈敏度高、同時適用所有糖修飾形態等諸多優勢。

對于單抗藥物的復雜糖基化,離子色譜可以從三個方面給予解析:

1.糖鏈水平的分析——N糖圖譜測定

N—糖基化修飾的糖鏈可以通過肽糖苷酶F或肽糖苷酶A酶切作用,或者肼解作用從糖蛋白上釋放出來。糖鏈經凈化后可直接進樣,無需衍生,避免了衍生化過程中唾液酸化聚糖的結構改變


Ofatumamab的N糖圖譜

離子色譜還可以和高分辨質譜聯用,實現對色譜峰的鑒別。以Q Exactive為代表的Orbitrap超高分辨率質譜對未標記的糖具有高靈敏度,可解析糖鏈結構。安培檢測器、高分辨質譜和離子色譜聯用,可同時解決糖鏈的定性和定量分析


2.單糖組成測定

單抗糖鏈主要由葡萄糖胺、半乳糖胺、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等單糖組成。單糖組成測定可以從基礎水平上對單抗的糖組成差異給出解析。

對于中性糖和氨基糖的分析,通常使用酸水解的方式,使蛋白中的單糖釋放。樣品水解后,直接進樣,無需衍生


3.唾液酸的測定

唾液酸存在于單抗的糖鏈末端,對于單抗在生物體內功能的發揮起著相當重要的作用,影響藥物的有效性。唾液酸的差異,是人源抗體和其他生物抗體差異的一個指標。唾液酸的釋放,可使用溫和酸水解或酶解。使用離子色譜分析游離的唾液酸樣品,可直接進樣,無需衍生。不同結構的唾液酸在CarboPac PA10色譜柱上可以得到快速高效的分離


綜上所述,離子色譜(IC)可用于單抗藥物的聚糖圖譜分析、單糖組成分析、唾液酸測定等方面。糖型檢出覆蓋率更高,適用于復雜唾液酸修飾糖型,極大的完善和推動了糖蛋白類藥物N-糖鏈的質控分析。

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